免疫組化染色注意事項:
免疫組化染色方法已不是什么很難的問題，操作步驟簡單也易掌握，但要染好免疫組化，其中方法的技巧將是每位操作者在實際工作中不斷摸索和探討的事：
（1）去除內源酶及內源性生物素　
一般我們進行免疫組化標記的都是一些生物體組織，其中自身含有一定量的內源酶和內源性生物素，而免疫組化各種染色大部分是用過氧化物酶來標記抗體的，酶的作用是催化底物，使顯色劑顯色，而組織中的內源性酶同樣也能催化底物，使其顯色，這就影響免疫組化的特異性，所以在標記抗體的過氧化酶進人組織切片之前就應設法將組織內的內源性各種酶滅活，以保證免疫組化染色在特異性情況下進行。
1) 去除內源酶　
常用的去除內源性酶的方法是3%過氧化氫水溶液。但在含有豐富血細胞的標本中，由于其中含有大量的具有活性的過氧化物酶，能與過氧化氫反應，出現氣泡現象，易對組織結構和細胞形態產生一些不良影響，但用3%過氧化氫的方法，能夠去除大部分內源性酶，即使有些血細胞在顯色后也出現棕黃色反應，但由于其形態結構與組織細胞不同，也易鑒別，而且此方法比較通用易操作，但應注意過氧化氫的濃度不能過高，一般為3%一5%，時間不宜過長，室溫10min。
2) 去除內源性生物素　
在正常組織細胞中也含有生物素，特別是肝、脾、腎、腦，皮膚等組織中，在應用親和素試劑的染色中，內源性生物素易結合卵白素，形成卵白素一生物素復合物，導致假陽性，所以在采用生物素方法染色前也可以將組織切片進行0.01%卵白素溶液室溫處理20min，使其結合位點飽和，以消除內源性生物素的活性。
3) 滅活堿性磷酸酶　
zui常用的方法是將左旋咪挫(以每毫升加24mg)加入底物液中并保持pH值為7.6~8.2，能除去大部分內源性堿性磷酸酶，對于仍能干擾染色的酸性磷酸酶可用0.05mo1/L酒石酸抑制。
（2）抑制非特異性背景著色　
非特異性著色zui常見的情況是抗體吸附到組織切片中高度荷電的膠原和結締組織成分上，而出現背景著色，為了防止這種現象，用特異性抗體來源的同種動物滅活的非免疫血清在特異性抗體之前進行處理，以封閉荷電點，不讓一抗與之結合，但這種方法一般實驗室很難實現，一般常見實用的血清是2%~10%羊血清或2%牛血清白蛋白在室溫下作用10~30min即可，但應注意此種結合是不牢固結合，所以不要沖洗，傾去余液直接加一抗，對于多克隆抗體來講，易產生背景著色，在稀釋特異性抗體時可采用含1%非免疫血清的pH7.4的PBS液。
（3）緩沖液　
免疫組化染色標記是對生物體組織抗原進行標記，抗原抗體的pH值為7.2~7.6，zui常用的是0.0l mol / LpH7.4磷酸緩沖液(PBS)。簡易配法：5000ml蒸餾水中分別加入l g NaH2PO4、15.6gNa2HPO4 、42.5gNaCl。但如果是采用堿性磷酸酶(AP)作為標記物底物的方法時可以用0.02mol/L TBS pH8.2緩沖液比較好。
（4）抗原修復　
經甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低，這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因此，在染色時，有些抗原需先進行修復或暴露。
抗原修復方法可分為化學方法和物理方法。化學方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶及胃蛋白酶，配制濃度與消化時間要適度。常用的物理方法有單純加熱、微波處理和高壓加熱。在選用這三種加熱法時，浸泡切片的緩沖液的離子強度和PH值、加熱的溫度和時間均影響著抗原修復效果。目前zui常用的修復方法有如下凡種：
1）胰蛋白酶(Trpsin)　　
主要用于細胞內抗原的修復。一般使用濃度為0.1%，37℃作用10min。
配法：0.1g胰蛋白酶加入到0.1%pH7.8CaCl2(無水)水溶液中溶解后即可。
2）胃蛋白酶(Pepsin)　　
主要用于細胞間質或基底膜抗原的修復。一般濃度為0.4%，37℃作用30min。
配法：0.4g胃蛋白酶溶于0.lmol/L HCl水溶液中。
3）熱引導的抗原決定簇修復(Heat Induced Epitope Retrieval，HIER)　
HIER對大多數的抗體有益，尤其是對核抗原的修復作用更加明顯，zui常用的抗原修復液是pH6.0的枸櫞酸緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現的?？乖迯鸵旱?/span>pH值非常重要，有效的抗原修復pH值要比修復液的化學成分更重要，同樣的修復液隨著pH值的升高染色的強度逐漸增強，但*pH值范圍為6.0~10.0，對于大多數抗原這個范圍的pH值都能進行有效的修復，有些抗體(如Ki-67、ER)則在pH值l.0~3.0和6.0~8.0更為有效。作為通用修復液堿性pH值的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH值的修復液則優于堿性的修復液，所以兩種抗原修復液可作為相互替補的進行抗原修復。在進行HIER過程中應防止切片的干燥，加熱時必須達到規定的溫度，保溫時間要足夠，對于一些不要抗原修復的抗體不要采用HIER處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復聯合應用。
HIER方法有：
1)水浴加熱法　
將脫蠟入水后的切片放人盛有修復的容器中，放人加熱煮沸水中，當修復液溫度達到95℃左右時計時l5min，自然冷卻，PBS洗3min×3次。
2)微波加熱法　
將切片放入修復液中微波加熱使溫度在96℃左右，計時l0min，在微波爐中停留2min，室溫自然冷卻，PBS洗3min×3次。
3)高壓加熱法　
將修復液在高壓鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使修復液淹沒切片)開始噴氣時蓋上壓力閥。計時2min，冷水沖至室溫取出切片，PBS洗3min×3次。
（5） 顯色　
免疫組化染色的顯色是zui后的關鍵問題，一般辣根過氧化物酶(HRP)的檢測系統選用DAB或AEC顯色系統進行顯色。但要得到*的顯色效果，必須在鏡下嚴格控制，以檢出物達到zui強顯色而背景無色為zui終點，尤其DAB顯色時間短著色淺，時間長背景又深，都將影響結果判斷，根據經驗DAB在配制完后zui長宜放置30min以內，過時不能使用，DAB加到組織切片時作用時間zui長不宜超過10min(在5min內)，否則不管有無陽性都應終止反應。對一些含有內源性酶較高的組織用DAB顯色時極易出現背景色更應盡早在鏡下控制，以達到*的分辨效果（棕色）。AEC顯色系統（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑，所以封片時應以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。
如果是堿性磷酸酶(AP)選用NBT/BCIP作為顯色系統（結果染為藍黑色）。
（6） 結果判斷　
免疫組化的結果判斷有兩種方法：
一是對以檢測結果陽性細胞指數來定性(如核抗原的標記)，判斷方法是以一個視野中的陽性細胞數與總細胞的百分比，再取10個相同視野算取平均指數。
另一種方法以染色陽性強度和陽性檢出率相結合而定，一般陽性細胞數在0~25為陰性，25~50為+，50~75為++，75以上為+++。此種判定方法容易出現人為誤差現象。
有條件的實驗室能用圖像分析系統進行結果檢測定量分析更為準確。一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結果判斷更標準，但各單位采取的標準不盡相同，所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學術界商討判定標準。
IHC中常見的抗原表達模式有以下幾種：
1）細胞漿內彌漫性分布，多數胞漿型抗體的反應如此，如細胞角蛋白(cytokeratin，CK)和波形蛋白(vimentin)等；
2）細胞核周的胞漿內分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如CD3多克隆抗體的染色；
3）胞漿內局限性點狀陽性，如CDl5抗體的染色；
4）細胞膜線性陽性，大多數淋巴細胞標記的染色如此，如CD20、CD45RO；
5）細胞核陽性，如Ki-67及雌、孕激素受體蛋白ER、PR等。一種抗體可同時出現細胞漿和細胞膜的陽性表達，如EMA可呈膜性和胞漿內彌漫性陽性反應；CD30抗體可同時呈膜性和胞漿內點狀陽性反應等。
（7） 對照片的設置　
免疫組化的質量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組化結果是毫無意義的。對照包括陰性對照、陽性對照和自身對照。在實踐中可用染色組織切片中不含抗原的組織作為陰性對照，而用含抗原的正常組織作陽性對照，這種自我對照具有節約的意義。觀察染色結果時，先觀察對照組織的結果，如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽性，陰性對照細胞呈陰性，內源酶陰性，背景無非特異性染色時，表明本次實驗的全部試劑和全過程技術操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結果。 免疫組化染色中對照片的設置非常重要，它是判斷您的染色是否成功的關鍵依據，而且也是檢測每一個抗體的質量標準，常設的對照如下，一般實驗zui常用的只選第二種方法。
1）空白對照(陰性對照)　 *抗體由PBS或非免疫血清取代。
2）陽性對照　 用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。
3）回收實驗陰性對照　已知抗原與相應的*抗體混合，發生結合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結果為陰性。
4）替代對照　用于*抗體同種動物的血清或無關抗體代替*抗體結果為陰性。
5）自身對照　在同一切片上，應將不同組織成分中的陽性或陰性結果與檢測的目的物對照比較。如actin、CD34在正常組織中的血管壁肌層應為陽性，vimentin可以間質細胞，對照desmin以血管壁及肌束為對照，S-l00蛋白以小神經末梢為對照等，如果應為陽性的組織是陽性，則免疫組化技術正確，如為陰性，則表明染色技術有問題或免疫試劑質量有問題。

免疫組化技術要點:
1. 固定
用4%的多聚甲醛固定液。對于冰凍切片，甲醛固定有時比冰凍丙酮好；但對于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時候商品化的抗體會有比較適合而推薦的固定液，請于購置前注意說明書。
（1）BouinS固定液：飽和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對組織的穿透力較強，固定較好，結構完整，但因偏酸，對抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標本的長期保存。
（2）PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對超微結構及許多抗原的抗原性保存較好。
2. 組織脫水、透明
時間不能太長，否則在切片時容易碎片，切不完整。
3. 切片時展片
有些組織在切片后難以在水中展開，這時可適當地在水中加入幾滴乙醇。
4. 烤片
60℃ 30分鐘或37℃ overnight，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。
5. 蠟塊及切片的保存
在4℃保存
6. 脫片問題
Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進行下一步。
7. 滅活內源性酶
（1）HRP系統：3%雙氧水滅活
（2）AP系統：3%HAc滅活。
8. 暴露抗原
對于石蠟切片的免疫組化實驗時，必須采用高溫加熱抗原修復，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強度(不同抗體的*修復液請參閱抗體說明書)。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應不一樣，可進行熱修復、胰酶消化、既不修復也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。
9. 封閉
在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉
10. 抗體稀釋
應遵循“現用現配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當天使用。
11. 背景高
在抗體濃度、反應時間、反應溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。
12. 返藍
在蘇木素復染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na2HPO4的飽和溶液返藍。
13. 顯色
一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。
14. 在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色。
15. 拍照
免疫組化切片一般染色不太深，因此拍攝出的照片顏色較淺，就讓它淺。拍攝出的照片中空白部位應盡可能呈現純白色。測量其灰度應在250左右。如果呈現淡藍色，一般是相機自動白平衡在起作用。另外一個因素是顯微鏡燈光電壓不正確。要使燈光本身的色溫正確。既不偏黃，也不偏藍。